Armaghane Danesh

fa کلون کردن اپیتوپ‌های خطی آنتی ژن P14-3-3 در وکتور pEGFP-N1 به عنوان یک مدل واکسن DNAجهت القا ایمنی علیه کیست هیداتیک و بررسی بیان آن در رده سلولی CHO Prediction and cloning linear Tcell epitopes of P14-3-3 antigen into pEGFP–N1 as a DNA vaccine model to induse immuno response against hydatidosis and it's expression in CHO cell line انگل شناسی Parasitology پژوهشي Research زمینه و هدف: کیست هیداتیک در اثر آلودگی با لارو انگل اکینوکوکوس گرانولوزوس ایجاد میشود. در مرحله لاروی این انگل آنتیژنهای متعددی تولید میشود که یکی از این آنتیژنها، آنتیژنی از خانواده پروتئینهای p14-3-3 میباشد و واکسن نوترکیب آن ایمنی‌زایی قابل توجهی را در موش القا کرده است. با توجه به ایمونوژنتر بودن نواحی اپیتوپی آنتیژنها و تولید پاسخ ایمنی  Th1 مطلوب هدف از این مطالعه کلون کردن اپیتوپهای خطی این آنتیژن شناسایی شده در وکتور N1–pEGFP بود که در ساخت یک مدل  DNA واکسن مؤثر بود. روش بررسی: در این مطالعه تجربی پس از شناسایی اپیتوپهای خطی آنتیژن p14-3-3 توسط نرمافزارهای بیوانفورماتیکی، توالی             کدکننده آن به صورت سنتتیک فراهم شد، پس از تکثیر با واکنش PCR  و هضم توسط آنزیم محدود کننده  ‌XhoI، در وکتور            N1 – pEGFP تخلیص شده با روش سمبروک تغییر یافته که همراه  با استفاده از CaCl2 وPEG6000  میباشد کلون شده و کلونیهای مثبت حاوی وکتور نوترکیب ابتدا به روش colony PCR و سپس توالی‌یابی تأیید شد. برای بررسی بیان در سلولهای یوکاریوت با روش الکتروپوریشن به رده سلولیCHO  منتقل شدند. یافتهها: توالی کد کننده اپیتوپهای خطی آنتیژن P14-3-3 انگل اکینوکوکوس گرانولوزوس پس از شناسایی، سنتز و تکثیر در وکتورpEGFP-N1 که تخلیص آن  با روش جدید به خوبی با حداکثر غلظت پلاسمید و حداقل مقدار RNA همراه است، کلون شده و پس از تأیید کلونینگ، بیان آن نیز در رده سلولی CHO به عنوان نمونهای از سلولهای یوکاریوت به صورت موفقیتآمیز با میکروسکوپ فلورسنت انجام شد و استفاده از سازه حاصل در قالب واکسن ژنی برای  بررسی پاسخ ایمنی در مدلهای موشی در مراحل بعدی پژوهش انجام خواهد شد. نتیجهگیری: نتایج حاصل از توالی یابی، تأیید کننده کلونینگ صحیح توالی کد کننده اپیتوپهای خطی آنتیژن &zeta P14-3-3 انگل اکینوکوکوس گرانولوزوس در وکتور pEGFP-N1  بوده و نتایج حاصل از میکروسکوپ فلورسانس نشانگر بیان موفقیتآمیز پروتئین نوترکیب در سلول یوکاریوتیCHO میباشد. واژه‌های کلیدی: اکینوکوکوس گرانولوزوس، کلونینگ، DNA واکسن،P14-3-3 خش وارد کنید ABSTRACT Background & purpose: Hydatidosis is a zoonotic disease that caused by infection with the larvae of Echinococcus granulosus. Different antigens produced in larval stage of this parasite that recombinant vaccine base these antigens created significant immunity in infected animals. One of the important antigens is p14-3-3 that it's recombinant antigen created considerable immunity in mouse models. In this study according to the high immunity of antigen epitopes region the coding sequence of T-cell epitopes of P14-3-3 was cloned into pEGFP-N1vector in order to produce an effective DNA vaccine model to stimulate high level of Th1 immune response.   Material and method: In this study bioinformatics tools were used to prediction of linear T-Cell epitopes of Echinococcus granulosus P14-3-3 &zeta antigen. The nucleotide coding sequence of these epitopes was synthesized by PCR. the ampliqon was digested with XhoI restriction enzyme and cloned into pEGFP–N1 vector That has been purificated by modified sambrook method with CaCl2 and PEG6000..Positive colony was selected by direct colony PCR and confirmed by the sequencing.and evaluation of it's expression in Eukaryotic cells was done by transformed to CHO cell line with electroporation. Results: Linear T-cell epitopes of Echinococcus granulosus P14-3-3 after prediction,synthesis and amplification wae successfully cloned into pEGFP-N1 vector that purificated by new method with maximum vector and minimum RNA concentration.The expression of new constract in CHO cell line as a eukaryotic cells achivment by fluorescent microscope and will be used as a DNA vaccine model to evaluation immuno response in mouse models.   Discussion: Successfully cloning of The linear T-cell epitppes coding sequence of Echinococcus granulosus P14-3-3&zeta antigen into pEGFP-N1 verificated by sequencing and fluorscent microscope images demonstrated expression of recombinant protein in CHO cell line اکینوکوکوس گرانولوزوس,کلونینگ,DNAواکسن, P14-3-3 Echinococcus granulosus, DNA vaccine, cloning, P14-3-3 666 676 http://armaghanj.yums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-249-1&slc_lang=fa&sid=1 R mesri رقیه مصری 100319475328460018277 100319475328460018277 No 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran گروه سلولی و مولکولی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران M Esmaelizad مجید اسمعیلی زاد m.esmaelizad@rvsri.ac.ir 100319475328460018278 100319475328460018278 Yes 2Department of Central labratoary, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, Alborz, Iran. آزمایشگاه مرکزی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، البرز، ایران SA Angaji سید عبدالحمید انگجی 100319475328460018279 100319475328460018279 No 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran گروه سلولی و مولکولی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران M Tahmaseb محمد طهماسب 100319475328460018280 100319475328460018280 No 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran گروه سلولی و مولکولی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران M Ahmadzadeh مژگان احمدزاده 100319475328460018281 100319475328460018281 No 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran گروه سلولی و مولکولی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران S Mohammadi سمیه محمدی 100319475328460018282 100319475328460018282 No 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran گروه سلولی و مولکولی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران