fa ساخت یک سازه بهینه شده لنتی ویروسی نوترکیب حاوی ژن pdx-1 برای انتقال ژن به سلول‌های بنیادی در راستای ژن درمانی دیابت نوع 1 تخصصي Special پژوهشي Research چکیده زمینه و هدف: امروزه بسیاری از پروتکل‌های ژن درمانی با حامل های لنتی ویروسی انجام می شود. یکی از مهم‌ترین فاکتورهایی که در تکوین پانکراس و رونویسی ژن انسولین نقش دارد فاکتور رونویسی Pancreatic & duodenal homeobox 1 (Pdx-1) است. هدف از این مطالعه بهینه‌سازی سازه لنتی ویروسی حاوی ژن pdx-1 برای ترانسفکشن سلول‌های بنیادی در راستای ژن درمانی دیابت نوع 1 بود. روش بررسی: در این مطالعه تجربی ابتدا ژن pdx-1 از حامل pcDNA3.1-pdx-1به وسیله PCR تکثیر و در حامل pTG19–Tکلون شد. سپس ژن pdx-1 در بالا دست ژن IRES–EGFPدر حامل pIRES2–EGFP ساب کلون شد. در مرحله بعد قطعات کلون شده‌ IRES–EGFP و نیز pdx-1 با هضم آنزیمی ‌از حامل مربوطه جداسازی و به درون سازه ی بیانی لنتی ویروسی pSINTREM در بالا دست ژن TRE-CMVکلون شدند. سازه‌ی نهایی پس از تعیین توالی به سلول‌های HEK293 ترانسفکت شد و بیان ژن pdx-1 به وسیله آنالیز فلوسایتومتری و میکروسکوپ معکوس فلورسنت ارزیابی شد. یافته‌ها: نتایج فلوسایتومتری و نیز مشاهده مستقیم با میکروسکوپ معکوس فلورسنت، نشانگر تأیید بیان ژن‌های pdx-1 و GFP در سلول‌های HEK293 ترانسفکت شده با سازه نوترکیب نهایی بود. نتیجه‌گیری: با توجه به این که سازه حاضر به منظور تضمین بیان طولانی مدت با بازدهی بالا در سلول‌های بنیادی طراحی شده و از سامانه ی القایی Tet onهای در آن استفاده شد، می‌تواند یکی از بهترین سازه‌ها در جهت انتقال هر نوع ژن به سلول‌های بنیادی باشد. واژه‌های کلیدی: ژن درمانی، دیابت، سلول‌های بنیادی Abstract Background & aim: Nowadays, most of gene therapy protocols are performed by lentiviral vectors. One of the most important factors which is involved in pancreas development and transcription of insulin gene is pancreatic & duodenal homeobox 1 (PDX-1) transcription factor. The goal of this study was to optimize a lentiviral construct, containing pdx-1 gene, to transfect stem cells towards gene therapy of type-1 diabetes. Methods: In this experimental study, first, the pdx-1 gene was multiplied by PCR from pcDNA3.1-pdx-1 and cloned into pTG19-T vector. Then, pdx-1 was subcloned on upstream of IRES-EGFP gene into IRES2-EGFP vector. At the next step, the cloned parts of IRES-EGFP and pdx-1 were isolated and cloned into the lentiviral expression vector pSINTREM in upstream of TRE-CMV gene. After sequencing, final construct was transfected into HEK 293 cells and gene expression of pdx-1 was evaluated using flow cytometry analysis and reverse fluorescent microscopy. Results: Flow cytometry results and inverted fluorescent microscopy observing showed that pdx-1 and GFP genes are expressed in cells transfected with final recombinant construct. Conclusion: Regarding the design of this construct, to ensure long time expression with higher in vivo and in vitro expression efficiency for stem cells and also use of Tet on induced optimized system, it seems that the current construct can be among the best ones to transfect stem cells. Key words: Gene therapy, Diabetes, Stem cells واژه‌های کلیدی: ژن درمانی, دیابت, سلول‌های بنیادی Key words: Gene therapy, Diabetes, Stem cells 484 493 http://armaghanj.yums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-258&slc_lang=fa&sid=1 S Rahmati سامان رحمتی 10031947532846001893 10031947532846001893 No M Karimi Arznani محسن کریمی‌ارزنانی 10031947532846001894 10031947532846001894 No K Parivar کاظم پریور 10031947532846001895 10031947532846001895 No M Kadivar مهدی کدیور Kadivar@pasteur.ac.ir 10031947532846001896 10031947532846001896 Yes